聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种重要的生物分离技术，普遍应用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离、化和分析。该技术基于待测物质在电场中的迁移速度与其分子量、电荷及形状的差异而实现分离。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体在催化剂（如过硫酸铵）和加速剂（如四甲基乙二胺，TEMED）的作用下，通过聚合反应形成长链，再经交联剂（如N,N'-亚甲双丙烯酰胺）作用交叉连接而成的三维网状结构高分子聚合物。这种凝胶具有特的孔隙结构，其孔径大小可通过调整丙烯酰胺和交联剂的浓度比例来控制。这种可控的孔径使得聚丙烯酰胺凝胶成为一种理想的分子筛材料。

聚丙烯酰胺凝胶的制备通常在两块封闭的玻璃平板所形成的夹层间进行，以减少氧对聚合反应的控制作用。灌制好的凝胶经过聚合反应后，形成一层均匀、透明的凝胶层，用于后续的电泳分离。

电泳是指在电场作用下，带电粒子在电场中发生迁移的现象。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，待测样品（如蛋白质或核酸）起先被加入到凝胶的上端，然后通过施加电场，样品中的带电粒子会向凝胶层的另一端移动。

1、电荷效应：待测物质在电场中的迁移速度与其所带电荷的数量和性质有关。正电荷的粒子向阴迁移，负电荷的粒子向阳迁移。由于大多数蛋白质和核酸分子在生理条件下带负电荷，因此它们在电场中向正迁移。

2、分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小对待测物质的迁移速度产生重要影响。小的分子可以快通过凝胶的孔隙，而大的分子则受到愈大的阻力，迁移速度较慢。这种分子筛效应使得不同大小的分子能够在凝胶中形成清晰的带状分离。

3、浓缩效应：在电泳过程中，由于电场的作用，样品中的带电粒子被压缩成一条狭窄的区带，这增强了分离效果。当电场强度足够高时，样品中的粒子会紧密排列在凝胶的起始端，形成一条明显的起始线。随着电泳的进行，这条线会逐渐向凝胶的另一端移动，并形成不同大小的带状区域。

影响电泳分离效果的因素：

1、电场强度：电场强度越大，带电粒子的迁移速度越快。但是，过高的电场强度可能导致热量积累，影响分离效果。因此，在选择电场强度时需要考虑样品的性质和凝胶的孔径大小。

2、凝胶浓度：凝胶浓度越高，其孔径越小，对大分子的阻力越大。因此，通过调整凝胶浓度可以控制不同大小分子的分离范围。一般来说，对于小分子物质，选择低浓度的凝胶；对于大分子物质，选择浓度较高的凝胶。

3、缓冲液：缓冲液在电泳过程中起到维持恒定pH值和离子浓度的作用。适当的缓冲液可以保持带电粒子的稳定性和迁移速度的一致性。常用的缓冲液包括Tris-HCl、Tris-甘氨酸等。

4、电压与电流：电压和电流是影响电泳速度的重要因素。一般来说，电压越高，电泳速度越快；但过高的电压可能导致凝胶过热和破坏。因此，在选择电压时需要综合考虑样品的性质、凝胶的浓度和电泳设备的性能。

5、温度：温度对电泳速度也有相应影响。一般来说，随着温度的升高，分子的运动速度加快，电泳速度也会相应增加。但是，过高的温度可能导致凝胶的软化和破坏，因此需要控制电泳过程中的温度。

聚丙烯酰胺凝胶电泳在生物学和医学研讨中具有普遍的应用价值。它可以用于分离和化蛋白质、核酸等生物大分子；用于分析蛋白质的分子量、等电点等理化性质；还可以用于检测基因突变、病痛相关蛋白的表达水平等。